多糖初探自聚制备硬脂燕麦一特性集胶及其酸修饰的束的-知乐云舍

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一些疏水性活性物质所具有的硬脂燕麦各种药理作用已被广泛认可，然而其溶解性及稳定性较低，酸修饰的束限制了其在体内的多糖生物利用率及实际应用。为此，自聚制备研究出简单易得又对生物体无毒害作用的集胶及疏水性活性物质的载体，成为食品行业亟待解决的特性关键性问题。近年来，初探众多研究表明，硬脂燕麦将疏水性活性物质包埋或接枝于两亲性聚合物中，酸修饰的束可有效增加其溶解性，多糖从而提高其生物利用率。自聚制备天然活性多糖因具有特殊的集胶及结构，极好的特性功能特性，获得方法简单，初探易被降解等多项优点，硬脂燕麦成为主要关注对象。如将天然多糖进行疏水化修饰，利用其分子间和分子内疏水基团的相互作用，形成核壳结构的自聚集胶束。疏水药物或者其它生物活性物质包裹在内核中，亲水多糖链外壳不仅能提升其溶解性，增加胶束的稳定性，还能适当延长其在体内的循环，增加其吸收利用率。有学者提出，两亲性聚合物进入体内后，可能会与其生命系统呈现出更优的兼容性，与机体内营养元素或者各种酶类物质产生更好的相互作用，提升机体对物质的利用。两亲性多糖可在较低浓度下形成胶束结构，包载疏水性物质通过主动或被动运输方式，至病变部位，降低药物对正常组织的毒副作用。葡聚糖作为非离子型多糖的一种，不仅溶于水，还能够溶于二甲基亚砜（DimethylsulFoxide，DMSO）等有机溶剂中，使其在合成两亲性葡聚糖衍生物时更容易选择与葡聚糖和疏水分子相容的溶剂。与此同时，所合成的疏水化合物可以成为某些疏水性药物或活性物质的贮藏库，防止药物等过早降解和消除，有效提升这些疏水性活性物质的利用率，使其更好地发挥本身的多项功能。

本文利用硬脂酸对燕麦β-葡聚糖进行疏水化改性，得到两亲性燕麦β-葡聚糖，即燕麦β-葡聚糖硬脂酸酯（Oatβ-glucanstearateester，OGE），探究OGE的基本特性，为其作为疏水性药物或生物活性物质的载体提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

燕麦β-葡聚糖（80%），张家口一康生物科技有限公司；硬脂酸（分析纯），上海国药集团；N，N’-羰基二咪唑（99%），阿拉丁试剂有限公司；异丙醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、无水甲醇（分析纯），西陇科学股份有限公司；二甲基亚砜（分析纯），天津市大茂化学试剂厂；氘代二甲基亚砜（MethylsulFoxide-d6，DMSO-d6，99.9%）、二甲基亚砜（色谱纯）、正庚烷（色谱级）、溴化钾（光谱纯）、甲醇钠（分析纯）、硬脂酸甲酯（≥99%），阿拉丁试剂有限公司；荧光探针芘（≥99%，色谱纯），美国Sigma-Aldrich试剂公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清（Fatalbovineserun，FBS），索莱宝生物科技有限公司；Cellcountingkit-8（CCK-8试剂盒），日本同仁化学研究所。
6890N型气相色谱仪（配有FＩD检测器和Rev.A.10.02色谱工作站），美国AgilentTechnologies公司；ALPHA1-2冷冻干燥机，德国MartinChrist公司；NicoletFT-ＩR5700型傅立叶红外光谱仪，美国ThermoElectron公司；AL104电子天平，上海梅特勒-托利多仪器公司；旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；恒温磁力加热搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；TDL-5型离心沉淀机，上海飞鸽系列离心机厂；QL-861涡旋振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Milli-QAcademic超纯水系统，Millipore公司；BrukerAＶ600MHz核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克公司；场发射扫描电镜带能谱仪，日本电子电器公司；生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司；粒度和电位测量仪，英国马尔文仪器有限公司等；F-700荧光分光光度计，日本日立公司。

1.2 试验方法

1.2.1 燕麦β-葡聚糖硬脂酸酯（OGE）的制备

参照祝佩佩等的方法，并稍做修改。称取不同摩尔质量的硬脂酸于25mLDMSO后，置于70℃恒温水浴中至完全溶解，加入等量N，N’-羰基二咪唑混匀，70℃条件下反应15h后，获得硬脂酸酰基咪唑活化液。称取1g燕麦β-葡聚糖，完全溶解于20mLDMSO中，分别加入不同体积、不同浓度的硬脂酸酰基咪唑活化液，70℃、300r/min反应不同时间。待反应液完全冷却后，加入2倍体积的异丙醇醇沉10h，抽滤获得沉淀物质。将获得的沉淀物质完全溶解于80mL超纯水中，通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机成分，将产物置于透析袋中，依次用自来水、蒸馏水和超纯水各透析24h，冷冻干燥后备用。

1.2.2 OGE取代度的测定

1.2.2.1 标准曲线的绘制

本试验采用的脂肪酸甲酯的气相色谱条件参考杨滢等建立并验证的方法。准确称取一定量的硬脂酸甲酯标品溶解于正庚烷中，分别配制成质量浓度为3.20，1.60，0.80，0.40，0.20，0.10，0.05mg/mL的样液，利用气相色谱仪进样测定。记录出峰时间和峰面积，以出峰面积为纵坐标，硬脂酸甲酯的质量浓度（mg/mL）为横坐标绘制硬脂酸甲酯的标准曲线。
色谱条件：CP-Sil88型毛细管柱（100m×0.25mm×0.39mm，0.20μm，ＶarianＩnc，USA），FＩD检测器，检测器温度250℃，进样口温度250℃。

1.2.2.2 样品的取代度测定

取代度测定参照陈芳的研究方法，称取一定量的OGE于具塞试管中，加入0.50mLDMSO后使其完全溶解，加入1mL4mg/mL现配的甲醇钠甲醇溶液，置于80℃恒温水浴锅中密闭加热1h，取出反应液。待反应液完全冷却后加入1mL正庚烷和1mL饱和氯化钠溶液，静置分层。取上层清液过0.22μm膜，利用气相色谱仪测定样品中硬脂酸甲酯的含量，进而计算出样品的取代度。取代度（DS）按公式（1）计算。

式中，A—酰基含量（%）；M—酰基的分子质量。

1.2.3 单因素试验设计

1.2.3.1 硬脂酸酰基咪唑活化液添加量对取代度的影响

在硬脂酸活化液的添加量分别为2.50，3.50，4.50，5.50，6.50mL时，固定条件：反应温度70℃，反应时间4.0h。

1.2.3.2 反应温度对取代度的影响

在反应温度分别为70，80，90，100℃时，固定条件：硬脂酸活化液添加量4.50mL，反应时间4h。

1.2.3.3 反应时间对取代度的影响

在反应时间分别为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0h时，固定条件：硬脂酸活化液添加量4.50mL，反应温度70℃。

1.2.4 正交试验设计

在上述单因素试验的基础上，采用3因素3水平设计正交试验，以取代度的高低为基准探究OGE的最佳制备条件。前期单因素试验结果作为参考，硬脂酸活化液添加量（A）选取4.50，5.50，6.50mL；反应温度（B）选择70，80，90℃；反应时间（C）选择4.0，4.5，5.0h，探讨正交设计下各试验取代度的值，确定OGE的最佳制备条件。

1.2.5 OGE的物理特性表征

1.2.5.1 扫描电镜外观形态分析

取少量冻干样品于样品台上，置于离子溅射仪中镀一层导电金膜，利用扫描电镜观察OGE的外观形态，与燕麦β-葡聚糖的电镜图对比，在合适倍数下拍照记录。

1.2.5.2 粒径大小分析

称取不同取代度的OGE1.80mg于3mL超纯水中，加热至沸使其完全溶解，冷却至室温并补齐溶液至3mL，室温下搅拌36h，得到OGE的自聚集溶液。将制备好的自聚集溶液在5600×g下离心10min，取上层加入比色杯中，大约装至比色杯的1/3处，置于粒度仪中测定其粒径大小及PDＩ值。每个样品重复测定3次，并记录其平均值。